elisa

                                         

Se trata de una técnica de laboratorio que fue diseñada por científicos suecos y holandeses en 1971, que permite detectar pequeñas partículas llamadas antígenos, que habitualmente son fragmentos de proteínas. La identificación es específica, es decir, consigue que pequeños segmentos de proteínas destaquen y no puedan ser confundidas con otras.

Para poder identificar los antígenos se utilizan moléculas con dos componentes acoplados: un anticuerpo (que se une al antígeno de forma específica) y una enzima (que se activa y señala la unión al antígeno). Antes del descubrimiento del ELISA se utilizaban moléculas radioactivas en vez de enzimas, lo que suponía un riesgo añadido innecesario en el laboratorio y un mayor coste.

Gracias a esta técnica se han podido realizar estudios científicos en campos como la biología, la bioquímica y la medicina. En el hospital se utiliza principalmente para identificar gérmenes agresores que se encuentran en la sangre, orina, esputos, etcétera. La técnica pronto se generalizó con el empleo de equipos simples y muy baratos que se utilizan todavía hoy en muchos centros diagnósticos de todo el mundo.

tipos de elisa

ELISA NO COMPETITVOS

• ELISA directo:Es la forma más básica de realizar la técnica. Consiste en recoger una muestra a estudiar y ponerla en un pocillo (un recipiente pequeño) en frente de una muestra igual pero contaminada con el germen a estudiar, y otra muestra en la que se sabe que no hay germen. Se aplica el anticuerpo con la enzima en los tres pozos y se compara la muestra a estudio con las otras dos.
• ELISA indirecto:Se realiza de forma similar al ELISA directo, pero en este caso se añade primero un anticuerpo sin enzima y después uno con enzima. De esa forma, la señal que emite el enzima es mucho más potente y la prueba es más sensible.
  ELISA sándwich: En este caso en los pocillos primero se añade un anticuerpo y después la muestra, para que los antígenos queden ya retenidos en el fondo del pozo. Después se añade el anticuerpo con la enzima. Es la forma más eficaz de realizar la prueba.
  ELISPOT: Se trata de un tipo de ELISA que permite conocer de forma cuantitativa el antígeno, incluso identifica el número concreto de células donde se encuentra.

             Elisa competitivo

PASOS GENERALES

1.   Tapizado del pocillo con el Ag o Ac.​

2.   Adición de la muestra problema con la mezcla de Ags o Acs.​

3.   Unión del Ag o Ac específico al Ag o Ac tapizado en el pocillo.​

4.   Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac no unido.​

5.   Adición del Ac secundario marcado con la enzima.​

6.   Unión del Ac secundario al Ag o Ac.​

7.   Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida.​

8.   Adición del sustrato.​

9.   Unión del sustrato a la enzima.​

10. Coloración.

              

nefelometria y turbidimetria

                                 
                                                                   
                                   

• Turbidimetría: Es la medición de la luz transmitida a través de una suspensión, tiene la ventaja de permitir la valorización cuantitativa, sin separar el producto de la solución. Las mediciones, pueden efectuarse con cualquier espectrofotómetro.

• Nefelometría: Mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º).

 Utilidades

                                                               

 Turbidimetría

• Se utiliza para el análisis de fibrinógeno, triglicéridos, complejos Ag-Ac y otras sustancias.
•  Aplicable cuando la dispersión es suficientemente grande (concentración alta de partículas).

Nefelometría:

• Preferible para concentraciones bajas de partículas, ya que la dispersión es menor y la disminución de intensidad del haz incidente es pequeña.
• Se suele utilizar para medir concentraciones específicas de colonias de bacterias en algún medio de cultivo, o de muchas proteínas utilizando el principio de dispersión luminosa molecular.

componentes básicos de la nefelometria

1. Fuente de luz: los modelos más antiguos empleaban la lámpara de wolframio. En la actualidad se usan lámparas de arco de mercurio (Hg), diodos emisores o láser de helio-neón, de baja potencia.

2. Sistema colimador (innecesario con la lámpara de láser), cuya función es la de concentrar el rayo de luz en haces paralelos.

3. Selector de longitud de onda.

4. Cubeta de medición.

 5. Detector (fotomultiplicador).

6.Galvanómetro. Los primeros equipos de este tipo efectuaban la medición de la luz en un ángulo de 90º, pero hoy se prefiere trabajar con la detección en ángulo más pequeño, lo cual confiere una mayor sensibilidad.

Factores para la elección entre turbidimetría y nefelometría

• Intensidad de la radiación: transmitida o dispersada con la intensidad de la radiación procedente de la fuente. La mejor elección cuando la muestra contiene pocas partículas dispersantes es la nefelometría. La turbidimetría es buena cuando las muestras contienen grandes concentraciones de partículas dispersantes.
• Tamaño de las partículas dispersantes: En la nefelometría la intensidad de la radiación dispersada a 90º es mayor si las partículas son bastante pequeñas para que se produzca una dispersión Rayleigh. Si las partículas son mayores la intensidad de la dispersión disminuirá.En turbidimetría la señal consiste en la disminución relativa de la radiación transmitida, por lo que el tamaño de las partículas dispersantes es menos importante.

videos sobre nefelometria y turbidimetria

bibliografia: https://www.youtube.com/watch?v=WfUvgYg7BpU

cromatografia

      

Es la técnica para separar componentes de una mezcla, y su posterior análisis basado en que las distintas sustancias que forman los componentes de una mezcla se dejan arrastrar a diferentes velocidades sobre un soporte. El soporte puede ser papel, un gas, otro líquido, etc. Es un método físico de separación de componentes.

hay separación de componentes debido a las diferentes fuerzas de adsorción que ejerce el soporte sobre cada elemento.

Utilidad: 

Separar los distintos componentes de una mezcla, permitir e identificar , tanto como para determinar las cantidades de dichos componentes

Fases de la cromatografía:

• fase estacionaria: puede ser un sólido o un líquido que se queda fijo en la misma posición. por ejemplo; sólido poroso como yeso o papel filtro. 
• fase móvil: Puede ser un líquido o un gas que corre a través de una superficie y de la fase estacionaria. por ejemplo; fluido como agua o alcohol.

Tipos de cromatografia 

• Cromatografía plana: La fase estacionaria se coloca sobre un soporte plano, en este el flujo de fase móvil se consigue por capilaridad o por capilaridad y gravedad. Solo pueden emplearse líquidos como fases móviles.

-Cromatografía en papel: Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya es sencilla de implementar y no requiere de equipamiento sofisticado.

-Cromatografía en capa fina: La técnica es similar a la cromatografía en papel, a excepción que en este caso el análisis se realizará en una placa de plástic0, aluminio o vidrio cubierta de una capa de sustancia absorbente como alúmina o gel de sílice.

•   Cromatografía en columna: La fase estacionaria la forma un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio.La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por una nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.

-Cromatografía de intercambio iónico: Se trata de una cromatografía en columna que utiliza una fase estacionaria con sustancias con componentes con carga eléctrica. Se utiliza para separar compuestos cargados, incluyendo aminoácidos, péptidos y proteínas.

 -Cromatografía de exclusión: la fase estacionaria es un material poroso, que retine a las moléculas en función de su tamaño. En ocasiones se denomina  también cromatografía sobre geles o de permeabilidad en geles (GPC).

• Cromatografía de afinidad: La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando.

Los potenciómetros o pH metros, son instrumentos eléctricos que se utilizan para medir el pH de una disolución, por estar diseñados para determinar las concentraciones de iones hidronios que posea, lo que permite conocer con precisión su grado de acidez o basicidad.

Se utiliza para determinar la acidez o alcalinidad que posee cada sustancia. Este equipo usa electrodo para medir el “pH exacto” de una solución. Potenciómetro mide dos variables: “pH” y temperatura. El Electrodo no se ve afectado por gases disueltos, agentes oxidantes o reductores, materia orgánica, etc.

VÍDEOS Y DIAPOSTIVA RELACIONADO CON LA CROMATOGRAFIA Y POTENCIOMETRO

 



links:
http://www.labc.usb.ve/paginas/mgimenez/Lab_Circ_Electronicos_Guia_Teorica/Cap10.pdf.
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/principios_de_cromatografia.pdf.