La electroforesis, es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.



   

                                                   FUNDAMENTO

 Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas  en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir  cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). 

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará  este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado  las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía  cinética propia denominado  difusión.  La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión. 

                                                     MÉTODOS ELECTROFORESIS ZONALES

Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los  soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos  de convección del solvente. 
   Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros.  Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la  longitud del trayecto es mucho mayor  que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder,  cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos.

Los mas utilizado son:

• ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA:    Los geles de poliacrilamida se forman por  polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

•  ELECTROFORESIS EN GELES DE GRADIENTES.  

El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el límite del poro no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones más estrechas, además de incrementar el rango de pesos  moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración fija.

• ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.  

La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.

• ELECTROFORESIS CAPILAR

 La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. 

• ISOELECTROENFOQUE: Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa  en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. 
  
  
  
  
  Las moléculas amfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región del ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH  tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa  y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH  coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga  neta nula y se detendrán.  De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.

• ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL: La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.

MODOS DE DISPOSICIÓN DEL SOPORTE

Horizontal

En papel, para aminoácidos u otras moléculas pequeñas, y en soportes similares (especialmente, acetato de celulosa), para proteínas.En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y especialmente para ácidos nucleicos. Casi siempre el tampón cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente), denominándose por ello “electroforesis submarina”.

Soporte impregnado de disolución tampón por capilaridad, disuelve la muestra y mantiene el contacto eléctrico.

Se aplica la muestra depositándola (pipeta o aplicador específico) como una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel.

Vertical

Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se desliza), para proteínas o para ácidos nucleicos de pequeño tamaño.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido entre 2 placas rectangulares.
Contacto eléctrico y disolvente gracias al tampón que embebe el gel y llena las cubetas o compartimentos del ánodo y cátodo.

La muestra se deposita con micropipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel.
En cuanto a la composición del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente diferente).

                                                               APLICACIONES

• Determinación de la masa molecular
• Determinación del punto isoeléctrico
• Isoenzimas
• Mapas de restricción
• Secuenciación de ácidos nucleicos

PARTES DE ELECTROFORESIS

   COMPONENTES

• fuente de alimentación

• Dos electrodos (catodo +) y (Anodo -)

• Cubeta

• Tampón de electroforesis

• soporte electroforético (gel)

                        FUENTES DE ERROR EN LA ELECTROFORESIS

                  

La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del reactivo,  tiempo de corrida y preparación de las muestras.


                           FACTORES QUE AFECTAN  LA ELECTROFORESIS

• Carga neta

• tamaño

• intensidad del campo eléctrico

• temperatura

• medio soporte

• Buffer

bibliografia

• Ahmed, M.  Biotechnology : A Text Book. Ed. Global Media. India. 2009.56-57, 64-66pp
• http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis
• http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm